1.介绍

肝脏是机体代谢和解毒的主要器官。它在体内营养储存、异源物质代谢、抗氧化和免疫调节等方面发挥着至关重要的作用。然而，幼龄动物由于生理上的不成熟性，容易受到包括饮食和环境应激在内的各种应激源诱导的肝损伤。氧化应激被认为是肝损伤发生和发展的重要病理机制。过量的活性氧（ROS）可诱导脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤。更重要的是，自由基干扰线粒体动力学和生物能量学过程，进而引起线粒体结构和功能紊乱，进而加重肝脏细胞内氧化应激，触发内源性凋亡通路，最终导致肝脏损伤和功能障碍。因此，有必要制定有效的营养干预策略，保护动物免受氧化应激引起的肝损伤损伤。

近年来，人们尝试通过膳食抗氧化剂如植物营养素来改善肝脏健康。水飞蓟宾作为黄酮类木脂素的一种，是从水飞蓟中提取的水飞蓟素的主要活性成分，在消除ROS和调节抗氧化能力方面起着至关重要的作用。此外，水飞蓟宾还具有广泛的药理活性，如保肝、抗炎和抗菌活性，并通过调节生物发生和生物能量学来改善线粒体功能。据报道，饲粮中添加水飞蓟素/水飞蓟宾可以提高猪和家禽的生长性能，并对全身健康起到促进作用。与此一致的是，我们的前期研究也发现，饲粮中添加水飞蓟宾可以降低断奶仔猪腹泻发生率，提高生长性能；此外，水飞蓟宾可通过改善断奶仔猪的抗氧化性能、线粒体功能和微生物群落组成，有效缓解肠道损伤。然而，水飞蓟宾对氧化应激状态下断奶仔猪肝脏健康的有益影响及其潜在机制尚不清楚。

因此，本研究的目的是探讨水飞蓟宾在减轻百草枯（PQ）诱导的肝脏氧化损伤中的潜力。PQ是一种众所周知的氧化还原失衡诱导剂，可以通过干扰线粒体呼吸链上的电子传递而持续产生ROS，从而诱导不同器官的损伤，包括肝脏、胃肠道和其他器官。因此，它被广泛用于建立氧化应激模型。我们测量了饲粮中添加水飞蓟宾对肝脏病理改变、血浆生化参数、肝酶活性和炎症细胞因子含量的影响。随后，进一步分析了Nrf2/Keap1和NF-κB信号通路的激活、线粒体功能相关基因和蛋白的表达以及肝细胞凋亡的启动。我们的研究结果可以为改善断奶仔猪肝脏健康提供一种新的营养干预策略，并为水飞蓟宾在动物饲料中的加入和利用奠定理论基础。

2.材料与方法（略）

3.结果

3.1 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪肝损伤的影响

如图1A所示，H&E染色显示，PQ导致仔猪肝细胞肿胀和空泡变性，并伴有肝核固缩和核溶解。相反，饲粮中添加水飞蓟宾可缓解上述病理变化。与PQ组相比，饲粮中添加水飞蓟宾显著降低了PQ诱导仔猪肝脏病变的组织学评分（p<0.05）（图1B）。然后，我们进一步测定了血浆中AST、ALT和ALP的活性，发现PQ显著提高了ALT活性（p<0.05）。而饲粮中添加水飞蓟宾则会明显降低PQ诱导仔猪的ALT活性（p<0.05），并有降低AST活性的趋势（p=0.07）（图1C，D）。此外，常规饲粮和PQ处理均未影响仔猪血浆ALP活性（p>0.05）（图1E）。

3.2 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪肝脏氧化应激的影响

如图2所示，与对照组相比，PQ诱导仔猪GSH-Px活性显著降低（p<0.05），H₂O₂水平显著升高（p<0.05），T-AOC水平趋于降低（p=0.10），MDA含量趋于升高（p=0.08）（图2C-E）。相反，饲粮中添加水飞蓟宾显著提高了T-AOC水平，降低了MDA和H₂O₂浓度（p<0.05），并有提高SOD活性（p=0.06）和GSH-Px活性（p=0.06）的趋势（图2B-E）。各组间CAT活性差异无显著差异（p>0.05）（图2A）。

3.3 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪肝脏Nrf2信号通路激活的影响

如图3所示，我们发现PQ诱导显著降低了GPX4基因的表达（p<0.05），但对SOD1和GPX1基因的表达没有影响（p>0.05）（图3B-D）。然而，饲粮中添加水飞蓟宾显著提高了PQ诱导仔猪肝脏中SOD1mRNA表达量（p<0.05），并有提高GPX1（p=0.097）和GPX4（p=0.099）表达量的趋势（图3B-D）。添加水飞蓟宾和PQ处理均未影响肝脏中CAT mRNA的表达（p>0.05）（图3A）。有趣的是，Western blotting结果显示，在存在或不存在PQ刺激的情况下，添加水飞蓟宾增加了核因子NF-E2相关因子2 ( Nrf2 )蛋白的表达（p<0.05）（图3E-G）。

3.4 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪炎症反应的影响

如图4所示，与对照组相比，PQ诱导引起TNF-α和IL-8水平升高（p=0.05和p<0.05）（图4A,C）。与PQ组相比，水飞蓟宾显著扭转了这些趋势，增加了肝脏中IL-10的含量（p=0.08）（图4A,C,D）。与对照组相比，PQ处理后TNF-α和IL-8的mRNA相对丰度上调（分别为p=0.07和p=0.06）（图4E、G）。然而，饲粮中添加水飞蓟宾显著下调了表达（p=0.06和p<0.05）。此外，水飞蓟宾显著降低了PQ处理诱导的核因子-κB（NF-κB）和磷酸化NF-κB蛋白丰度的增加（p<0.05）（图4I,J）。

3.5 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪线粒体功能的影响

如图5所示，PQ诱导降低了线粒体复合物I和V的活性，随后降低了肝脏中的ATP含量（p<0.05）（图5A-C）。然而，与PQ组相比，饲粮中添加水飞蓟宾可缓解PQ诱导的线粒体复合体I和V活性降低，从而提高ATP的产生（p<0.05）。我们发现，与对照组相比，PQ处理降低了NADH泛醌氧化还原酶核心亚基V2（NDUFV2）的表达水平（p<0.05），并有降低ATP合成酶亚基d（ATP5H）的趋势（p=0.05）（图5D），而添加水飞蓟宾提高了PQ诱导仔猪肝脏中上述基因的表达（p=0.07和p=0.06）。此外，饲粮中的水飞蓟宾还上调了PQ诱导下NADH泛醌氧化还原酶核心亚基S2（NDUFS2）的mRNA表达（p=0.06）（图5D）。此外，PQ诱导增加了发动蛋白1（Drp1）的蛋白丰度，降低了线粒体融合蛋白2（Mfn2）的蛋白丰度，而添加水飞蓟宾显著逆转了上述趋势（p<0.05）（图5E-G）。

3.6 饲粮添加水飞蓟宾对PQ诱导仔猪肝细胞凋亡的影响

如图6所示，PQ诱导显著提高了肝脏中caspase3和caspase9的活性，而添加水飞蓟宾则逆转了这一趋势（p<0.05）（图5A,B）。有趣的是，饲粮中添加水飞蓟宾有降低未诱导仔猪caspase3和caspase9活性的趋势（p=0.07和p=0.09）。Western blot分析显示，与对照组相比，PQ诱导显著提高了肝脏中Cleaved caspase3的蛋白表达（p<0.01）（图5D）。相反，添加水飞蓟宾显著下调Cleaved caspase3的蛋白表达，上调b细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白表达，增加Bcl-2与Bcl-2相关x蛋白（Bax）的比例（p<0.05）（图5D、E、G）。此外，水飞蓟宾还增加了未诱导仔猪中Bcl-2蛋白的表达（p<0.01）（图5E）。各组间Bax蛋白表达差异无显著差异（p>0.05）（图5F）。

4.讨论

肝脏是哺乳动物体内代谢高度活跃的器官，在维持全身健康中起着重要作用，但极易受到各种因素引起的氧化应激的影响。本研究旨在探讨水飞蓟宾对PQ诱导断奶仔猪肝损伤的保护作用及其可能的分子机制。与先前的报道一致，组织病理学染色分析显示，PQ诱导引起肝脏明显的病理变化，表现为肝细胞核固缩、核溶解和空泡化。然而，添加水飞蓟宾可以减轻PQ引起的仔猪肝脏形态学损伤，病理学评分降低证明了这一点。之前的研究还表明，水飞蓟宾可以减轻CCl4诱导的肉鸡肝脏的纤维化、肉芽肿和细胞溶解性坏死。AST、ALT、ALP等血浆生化指标是肝损害程度最敏感的标志物，血浆中这些酶活性升高表明肝损害程度加重。在本研究中，饲粮中添加水飞蓟宾可降低PQ诱导仔猪血浆ALT和AST活性，提示水飞蓟宾可能对PQ处理引起的肝损伤具有保护作用。这些结果与张等人（2021）的研究结果一致，该研究证实，添加胶束水飞蓟素可显著降低母猪产后第21天血清AST活性。此外，添加水飞蓟宾降低了北京鸭血清ALT和γ-谷氨酰转肽酶的活性。综上所述，饲粮中添加水飞蓟宾对PQ诱导的仔猪肝损伤具有保护作用。

众所周知，维持适当的氧化还原平衡是减轻肝损伤的有效策略。肝细胞分泌的抗氧化酶是抵御氧化应激的第一道防线。尤其SOD是抗氧化酶系统的重要组成部分，催化超氧阴离子自由基歧化成氧和过氧化氢；后者经CAT进一步分解为水和氧。此外，GSH-Px还具有较强的清除自由基的能力，T-AOC可以反映机体的整体抗氧化能力。先前的研究表明，PQ诱导会引发仔猪严重的氧化应激。与此结果一致，我们的数据还显示，PQ处理降低了肝脏中GSH-Px活性和T-AOC水平，并增加了MDA和H₂O₂水平。更重要的是，饲粮中添加水飞蓟宾可提高SOD和GSH-Px活性以及T-AOC水平，从而降低H₂O₂含量和脂质过氧化水平。另一项研究也证实，添加水飞蓟素可以通过降低肝组织中蛋白质羰基含量来保护后备母猪免受氧化应激。江等（2020）报道，添加水飞蓟素可通过提高母猪血清中CAT和GSH-Px活性来缓解妊娠引起的氧化应激。这些结果表明，饲粮中添加水飞蓟宾可通过调节抗氧化防御系统的功能来缓解氧化应激。

如上所述，水飞蓟宾的保肝作用可能与其调节抗氧化能力密切相关。因此，我们进一步研究水飞蓟宾对肝脏Nrf2信号通路激活的影响。Nrf2/Keap1信号在抗氧化损伤中起重要作用。氧化还原状态受损诱导Nrf2与Keap1分离并易位到细胞核中，然后与抗氧化反应元件结合，调节下游抗氧化基因（如CAT、SOD和GPx）的表达，从而应对氧化应激诱导的细胞损伤。本研究发现，添加水飞蓟宾显著提高了Nrf2蛋白的表达，SOD1、GPX1和GPX4mRNA的表达也与Nrf2蛋白表达的变化趋势一致，说明饲粮添加水飞蓟宾增强了PQ诱导仔猪的抗氧化能力。我们前期研究发现，饲粮中添加水飞蓟宾可通过调节Nrf2信号通路提高断奶仔猪肠道抗氧化能力。另有研究表明，水飞蓟宾通过激活Nrf2/Keap1通路减轻硫代乙酰胺诱导的急性肝损伤。体外研究也证实，添加水飞蓟宾可通过调节Nrf2信号通路减清H₂O₂诱导的氧化应激。综上所述，饲粮中添加水飞蓟宾通过调节Nrf2信号通路，从而增强仔猪的抗氧化能力，减轻了肝脏损伤。

氧化应激可引发炎症反应，而炎症反应又可直接加剧氧化还原失衡。促炎细胞因子含量的增加与炎症反应的激活密切相关。在本研究中，与对照组相比，PQ升高了肝脏中TNF-α和IL-8的分泌及其基因表达。然而，饲粮中添加水飞蓟宾显著扭转了这一趋势，提高了PQ诱导仔猪的IL-10浓度，这表明水飞蓟宾通过减少促炎细胞因子的产生来减轻PQ诱导的过度炎症反应。与我们的研究结果一致，饲粮中的水飞蓟宾剂量依赖性地通过抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，改善了雷公藤甲素诱导的大鼠肝损伤。同样，水飞蓟宾可降低泌乳母猪血清TNF-α和IL-1β浓度。众所周知，NF-κB信号通路在炎症反应中起着重要作用，在受到外界刺激激活后，可促进下游靶基因的表达和炎症介质的分泌。先前的一项研究发现，PQ诱导通过提高断奶仔猪肝脏中NF-κB的磷酸化水平而引发炎症反应。在本研究中，PQ处理后P-NF-κB和NF-κB蛋白丰度也有所增加，但与PQ处理组相比，水飞蓟宾显著抑制了P-NF-κB和NF-κB蛋白的表达。NF-κB信号的钝化进一步降低了促炎细胞因子的表达，这与肝脏细胞因子水平的改变趋势是一致的。与我们的研究结果一致，一些研究也报道了水飞蓟宾抑制NF-κB信号级联以缓解肝脏炎症和脂肪性肝炎。综上所述，这些结果表明，饲粮中添加水飞蓟宾通过抑制NF-κB通路的激活来降低炎症细胞因子的表达，从而缓解肝脏炎症信号传导。

肝脏中含有大量线粒体，线粒体在细胞生物能量学、调节氧化还原平衡和细胞凋亡中起着至关重要的作用。线粒体呼吸链由5个酶复合物组成，主要负责通过氧化磷酸化产生ATP。氧化应激可通过扰乱细胞生物能量学而引起线粒体功能障碍。本研究发现，PQ诱导的氧化应激降低了肝脏线粒体复合体I和V的活性，降低了NDUFV2（复合体I）和ATP5H（复合体V）mRNA的表达水平。然而，添加水飞蓟宾减轻了PQ的有害影响，使呼吸链基因的异常表达正常化，随后恢复了仔猪肝脏线粒体复合物的活性，从而提高了ATP的产生。这与我们之前的研究一致，表明饲粮中添加水飞蓟宾通过增加断奶仔猪肠道线粒体复合物活性和ATP含量来改善线粒体功能。此外，另一项研究也表明，水飞蓟宾通过恢复肝脏线粒体呼吸链活性（所有五种复合物）来改善NAFLD诱导的小鼠肝损伤。线粒体功能的维持需要在分裂和融合过程之间取得适当的平衡。在本研究中，我们发现PQ处理增加了线粒体分裂相关蛋白Drp1的表达水平，降低了线粒体融合相关蛋白Mfn2的表达水平，这意味着PQ处理破坏了线粒体分裂和融合的平衡。相反，补充水飞蓟宾可显著改善PQ诱导下的线粒体动态失衡。一项体外研究也表明，水飞蓟宾处理通过调节OPA1和Drp1蛋白表达，保护人神经母细胞瘤SH-2SY5Y细胞免受H₂O₂诱导的线粒体损伤。综上所述，添加水飞蓟宾通过改善线粒体功能来保护仔猪免受PQ诱导的肝损伤。

先前的研究表明，线粒体功能障碍可加剧氧化应激并触发细胞凋亡，最终导致肝脏损伤和功能障碍。Caspase3是细胞凋亡过程中必不可少的刽子手，可被Caspase9异源激活。本研究发现，饲粮中的水飞蓟宾通过拮抗caspase3和caspase9活性的增加来抑制PQ诱导的细胞凋亡，这与之前的研究结果一致，即水飞蓟宾预处理降低了H₂O₂诱导的caspase-3阳性细胞的百分比，添加水飞蓟宾抑制了PQ刺激诱导的肠道caspase3和caspase9活性的增加。有趣的是，饲粮中添加水飞蓟宾也会降低未诱导仔猪肝脏中caspase3和caspase9的活性。这些结果表明，水飞蓟宾具有潜在的抗凋亡能力。在Bcl-2家族成员中，Bcl-2和Bax蛋白在调节细胞凋亡中发挥重要作用，前者具有抗凋亡作用，后者具有相反作用。在本研究中，添加水飞蓟宾通过增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和Bcl-2与Bax的比值，抑制促凋亡蛋白Cleaved caspase3的表达，从而阻止PQ诱导的细胞凋亡，这可能进一步阐明了饲粮中添加水飞蓟宾减轻PQ诱导的肝损伤的潜在机制。在体内和体外模型中也发现了类似的结果。综上所述，水飞蓟宾通过调节Bcl-2/Bax信号通路抑制PQ诱导的仔猪肝细胞凋亡。

5.结论

我们的研究表明，饲粮中添加水飞蓟宾可以减轻PQ诱导的氧化应激对断奶仔猪的肝损伤，其机制与增强抗氧化能力、减轻炎症反应、改善线粒体功能和抑制细胞凋亡密切相关。

这些研究结果为在动物饲料中应用水飞蓟宾作为抗氧化剂，通过饮食干预改善肝脏健康提供了理论依据。

参考文献（略）