博农利按语
在之前的文章中，已经探讨过动物肝脏损伤修复机制、骨骼及胸肌病的相关研究进展。本文，让我们通过一篇发表在《BMC Molecular and Cell Biology》的综述文章来全面了解家禽蛋壳的矿化沉积过程。
卵生鸟类的特点就是胚胎在子宫外的卵中发育，鸟类的卵具有保护性的矿化外壳，可以限制微生物的污染，此外其多孔的性质还可以允许胚胎与外部环境进行气体交换。与骨骼和牙齿不同的是，鸟类的蛋壳具有特殊的方解石形式的碳酸钙沉积，且形成过程没有细胞进行导向组装。文章主要探讨了最新的蛋壳结构和矿物学相关知识，以及蛋壳矿化过程中有机基质中蛋白的鉴定与功能表达的最新研究进展。
一、蛋壳的结构与组成
（一）蛋壳的整体结构
蛋壳具有高度有序的矿化结构，蛋壳的厚度、形态、大小及其结果和气孔特征在各物种间有所不同，但蛋壳的一般结构具有高度相似性，所有的鸟类蛋壳都是由三方相的碳酸钙——方解石在室温下最稳定的多晶态构成的。在绝大多数鸟类物种中，蛋壳的质量与蛋质量成正比，占蛋重的10-11%。迄今为止，对鸡蛋壳的研究最多。鸡蛋壳含有1.6%的水，包括蛋壳膜含有3.3-3.5%的有机基质和95%的无机矿物质。主要成分是碳酸钙(占其矿物部分的98.4%)，其中渗透着相当于壳重2.3%的有机基质。除了钙(37.5%)和碳酸氢盐(58%)外，磷也存在于外壳和角质层中。此外，外壳中还发现了大量的微量矿物质(即镁、锰、铜、锌)。
鸟类蛋壳由六层组成，最里面的两层是未钙化的内壳膜和外壳膜，它们由交错的蛋白质纤维组成，支撑着矿化壳，蛋壳膜形成或结构中的任何破坏都会阻止蛋壳的正常矿化。矿化壳被锚定在成核位点，即乳状突起，这是一种富含有机物质的结构，在蛋壳外膜表面呈伪周期性分布。方解石晶体的球形聚集体形成一列倒锥(乳突层)，随着矿化的进行，它们融合形成致密的栅栏层。从这个乳突层中，由大柱状单元(直径可达200μm)组成的栅栏层从乳状突起中延伸。栅栏层相当于蛋壳矿物厚度的三分之二，末端是垂直于壳表面的薄垂直晶体层，位于外壳矿物的表面。最外层是角质层，是沉积在蛋壳矿物质表面的蛋白质膜，它的内部区域含有羟基磷灰石晶体，以及大部分浅表蛋壳色素(2/3)。无数的孔隙穿透蛋壳；大多数物种的外口被角质层堵塞。气孔允许水和代谢气体的交换，这对胚胎发育至关重要。
图1 蛋壳结构
a: 交叉断裂的蛋壳的扫描电子显微照片
b: 蛋壳各层对应的标注图
蛋壳生物矿化过程遵循其有序形成的精确时间和空间控制。排卵时，卵黄从卵巢排出，并沿输卵管下行；依次获得漏斗部的卵黄膜(15min)、枕部的蛋清(3.5h)、白色峡部的蛋壳膜(1h)和远端红色峡部的一些有机聚集体(乳突核心)，最后进入子宫(19h) 。沉积在外层蛋壳膜表面的乳状突起是碳酸钙晶体异相成核的场所。当卵子进入子宫时，首先通过蛋白的水合作用(饱满化)获得其最终的卵圆形，从而使外层蛋壳膜与子宫粘膜紧密接触。蛋壳在脱细胞子宫液中矿化，子宫液钙和碳酸氢盐过饱和，并含有壳基质的有机前体。在蛋壳形成的顺序过程中，离子和有机成分的浓度会发生变化，即在卵子排出前开始矿化(5h)、线性沉积(12h)和壳钙化停止(2h)。在碳酸钙的线性沉积过程中(体内0.33g/h)蛋会旋转。
（二）蛋壳的超微结构
蛋壳矿化始于大量无定形碳酸钙(ACC)颗粒在乳状突起上的沉积(图1a)；ACC逐渐溶解并让位于方解石晶体。虽然无定形，但ACC似乎具有短程原方解石结构，这预先决定了它直接转化为方解石。蛋壳方解石晶体通过中间亚稳态无定形矿物相的溶解形成，在蛋壳生物矿化的线性阶段维持子宫液中的过高饱和，维持了方解石晶体的快速持续生长。尽管对于所有的碳酸钙多晶体(文石、球霰石、方解石和ACC)来说，卵线流体都是高度过饱和的，但只有方解石是由亚稳态ACC形成的，并且最终是成熟蛋壳中观察到的唯一矿物形式，这表明对蛋壳矿物学有严格的控制。
图2b-d显示了通过扫描电子显微镜(SEM)和光学显微镜观察到的蛋壳超微结构特征。蛋壳矿物部分约320μm厚(鸡)，由垂直于蛋壳外表面排列的致密柱状单元(栅栏)组成，这些柱状单元来自于附着在蛋壳膜上的锥形乳状突起(图2b)。在光学显微镜下观察蛋壳的薄抛光切片时，在横截面上可以看到由细长方解石晶体组成的栅栏，宽约70-80μm，延伸到蛋壳矿物厚度上，并且由于其晶体学取向的差异而表现出不同程度的消光(图2c)。蛋壳中含有大量被遮挡的有机物(约2%)，它们分布在蛋壳的整个栅栏区域，并且在乳状层的上部以最高的浓度存在，这可以在平行光照下观察到(图2d)。
图2 蛋壳超微结构和显微结构
a: 扫描电子显微镜(SEM)图像显示钙化早期的蛋壳(排卵后6h)，在乳状突起上显示方解石晶体的聚集体，在壳膜上显示ACC平盘状颗粒
b: 扫描电子显微镜图像显示交叉断裂的蛋壳的栅栏层(PL)，乳突层(ML)和壳膜(SM)，蛋壳横截面的光学显微镜图像
c: 在交叉极化照明下观察，显示矿物的柱状方解石晶体单元
d: 在平行光下观察，显示矿物内部有机物的分布
在大多数鸟类蛋壳中通常观察到柱状晶体结构，柱状单位的密度和大小变化很小。这种柱状结构是方解石晶体从不同的成核位置(乳状突起)发育而来，尺寸增大，相互碰撞，因此它们只能向外生长，鸵鸟蛋壳的情况就是如此。珍珠鸡是一个值得注意的例外。它的蛋壳厚约500μm，钙化遵循与其他鸟类相同的模式，然而，钙化层中间晶体的大小和取向发生了新的变化(图3)。在珍珠鸡蛋壳中，大柱状方解石单元分解成具有不同晶体取向的较小晶体单元，形成了方解石晶体复杂交错的微观结构(图3b)。与其他鸟类相比，这种特殊的结构是珍珠鸡蛋壳具有特殊机械性能的原因。
图3 鸡(a)和珍珠鸡(b)蛋壳结构示意图和晶体取向的比较
黑色箭头表示方解石晶体c轴
二、蛋壳生物矿化过程中的分子控制
（一）调控蛋壳形成所需的矿物质供应
在蛋壳形成之前，壳腺(子宫)中并没有钙的储存。钙直接由离子血钙提供，每日2g的壳钙供给对于母鸡是一个巨大的代谢挑战。钙由母鸡的日粮直接通过肠道吸收提供，尽管其中40%的钙来自于骨骼活动，因为采食(白天)和蛋壳形成(主要发生在夜间)之间的不同步。在母鸡体内，钙储存库——髓质骨(约占总骨钙的12%)的存在促进了骨的日常吸收(图4)。在产蛋开始前约2周，雌激素和睾酮会诱导未成熟小鸡髓质骨的形成。在蛋壳形成过程中，髓质骨吸收增加了9倍，反映髓质骨增生的成骨细胞活性也被激活(2倍)以更新髓质骨。为适应蛋壳形成造成的钙吸收压力，母鸡在性成熟时表现出许多生理适应。鸟类对膳食钙产生特定的食欲，同时肠道对钙的吸收也随之增加。髓质骨与输卵管性成熟同时发育，具有分泌大量钙进入远端(子宫)管腔的能力。形成外壳的第二种必需离子——碳酸盐，来源于血液中的二氧化碳，通过碳酸酐酶(CA)将其水合成碳酸氢根离子。母鸡在蛋壳形成过程中表现出呼吸过度通气，以减轻因蛋壳形成过程中子宫液和血浆酸化引起的代谢性酸中毒。两种成分(Ca2+和CO32−)在蛋壳形成过程中均通过血浆持续供应，首先是通过子宫上皮的跨上皮离子运输，其次是通过ACC矿物颗粒的囊泡分泌。
图4 蛋壳钙化过程中钙和碳酸盐向子宫液转运的综合模型
通过子宫细胞进行离子转移的三种潜在途径是跨细胞、囊泡和胞旁机制。它们可以异步或以综合的方式运行。每个途径中的主要参与蛋白质如图(左)所示
（二）基质蛋白在生物矿化过程中的作用
蛋壳的有机基质在蛋壳的形成过程中起着基础性的作用，因此也在蛋壳力学性能的建立过程中起着基础性的作用。子宫液含有特殊的生物分子，可以特异性地选择方解石并稳定ACC。体外实验、原位观察和遗传关联分析证实了有机基质成分对蛋壳矿化的主动控制。
第一个实验论点是，在蛋壳矿化的不同阶段，子宫液的有机组成发生了变化，这表明在钙化过程中，子宫液的蛋白质库存发生了变化。由于壳中所含的有机基质部分具有钙结合特性，壳和子宫液的可溶性有机部分以剂量依赖性方式调节碳酸钙沉淀。体外方解石结晶试验表明，子宫液增加了晶体的产生数量，减小了晶体的大小，加速了矿化动力学，并促进了方解石的排他性形成。
从壳或子宫液中分离出的单个蛋白质也观察到类似的效果。方解石晶体在溶菌酶、卵转铁蛋白、卵清蛋白或卵蓝蛋白-17存在下生长时高度修饰。鹅蛋壳钙素是一种卵绿素-17直系同源物，能够在体外诱导方解石晶体的结晶。
许多物理参数(疏水性、电荷等)改变了这些蛋白质在方解石晶体表面的吸附或排斥机制。许多蛋壳蛋白优先被平行于c轴的方解石晶体面吸收，从而改变生长的方解石晶体的形态，使其沿c轴伸长。这些修饰会影响蛋壳的微观结构(晶体的大小和取向)，从而影响其机械性能。意味着有机基质中特定蛋白质数量的变化会影响壳的机械性能。
此外研究结果表明，鸟类蛋壳的结构组织受到遗传控制，不同的鸟类会发育出具有特定微观结构特征的蛋壳。编码蛋壳有机基质蛋白的基因多态性与蛋壳表型之间的关联研究表明，特定蛋壳蛋白(卵清蛋白、卵黄蛋白-116、卵泡萼素-32)的多态性部分解释了某些蛋壳特性(即蛋壳厚度、晶体大小、晶体取向、蛋壳机械性能)的变化。在鸡的9号染色体和Z染色体上发现了包含与壳形态参数相关的基因的基因组数量性状位点区域(QTL)。最近的一项研究记录了118个与壳强度相关的QTL。其中，24种与抗断裂有关，33种与壳刚度有关。此外，在2号染色体上发现了断裂强度特征和壳刚度的共同QTL。其他QTL与几个壳质量参数(壳重、壳百分比、壳厚度、断裂强度和刚度)相同。因此，通过遗传辅助选择程序优化有益的蛋壳微观结构性状，可以提高蛋壳质量。蛋壳质量QTL与编码特定基质蛋白的基因之间的联系研究正在进行。老年母鸡产下的鸡蛋在蛋壳超微结构和微观结构特征(即缺陷类型、密度、方解石晶体单元的大小)方面表现出改变。这些结构变化被认为是老年母鸡鸡蛋蛋壳力学性能显著下降的部分原因。而对老年母鸡进行强制换羽，可以再生输卵管组织，部分恢复蛋壳强度并逆转蛋壳结构的变化。
（三）蛋壳基质蛋白清单
蛋壳膜合成并沉积在输卵管的峡部，为矿化蛋壳提供支撑基质。壳膜的主要成分是富含半胱氨酸的蛋壳基质蛋白(CREMP)，其含有大量的半胱氨酸。还存在胶原X、赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)和溶菌酶，其余(约25%)由多种蛋白质组成。
在蛋壳矿化过程中，子宫液中的蛋白质逐渐掺入矿化蛋壳中，约占钙化蛋壳重量的2%。随着基于功能基因组学的方法取得重大进展，已经可以识别多达900种特定的蛋壳蛋白。鸡基因组序列和相应的mRNA序列的发表使得使用基于质谱的高通量方法研究卵室蛋白质组成为可能。为了解决蛋白质组学研究的蛋白质注释的冗余问题，通过BLAST算法，在蛋壳层中鉴定出904种单一蛋白质，包括膜和角质层。另一项对鸡蛋壳基质的综合分析共列举了69种磷蛋白和182种N-糖蛋白，矿化部分共有676种蛋壳基质蛋白。
另外五种鸟类蛋壳蛋白质组也被广泛研究：在火鸡中鉴定出697种蛋白质，在鹌鹑中鉴定出622种蛋白质，在斑胸雀中鉴定出475种蛋白质，在鸭中鉴定出484种蛋白质，在珍珠鸡中鉴定出149种蛋白质。Le Roy等还比较了这五种鸟蛋壳蛋白质组，并鉴定出一组共有的119种蛋白质。基因组数据库的质量及其注释是分析其他鸟类蛋白质组学数据的限制因素，鸡基因组仍然是所有鸟类中最具特征的。
三、禽蛋壳矿化概述
文章试图整合现有成果，整理一个最新的、全面的鸟类蛋壳矿化模型。此方案涉及两种截然不同且互补的机制：
第一个机制涉及大量蛋白质，用于在无细胞子宫液中积极和持续地供应壳矿化所必需的离子；
第二个方面包括时间调节的有机基质蛋白质分泌，这些蛋白质调节壳的生物矿化。
离子和基质蛋白前体子宫液浓度的同步变化，以及有机成分与发育中的矿物相相互作用，导致了蛋壳生物矿化的精确特性。
（一）主动和持续供应壳形成所需的离子
钙的分泌主要通过子宫腺细胞沿浓度梯度进入子宫腔，钙结合蛋白和碳酸酐酶(CA)的存在证实了这一点。它还涉及其他离子的跨细胞转运体(Na+、K+、Cl-，H+)，这些离子参与钙分泌过程和维持细胞离子稳态。
文中提出了一个全面且进一步完善的模型，用于在蛋壳形成过程中将钙和碳酸盐输送到矿化地点(图4)。钙和二氧化碳来源于血液。血液CO2被动扩散到子宫细胞，在那里被CA2水合。或者碳酸氢盐可以使用离子泵主动转移到子宫细胞中。此外，碳酸氢根离子可以通过一氧化碳的水合直接在子宫液中产生。
肠道中存在一种细胞旁Ca2+摄取途径，当肠腔中的可溶性钙为被动吸收创造有利梯度时，起补充膳食来源的钙的作用。根据矿化阶段不同，子宫液中的离子钙浓度范围为6-10mM，比血钙水平(1-2mM)高6倍。
文章提到ACC被子宫上皮细胞内形成的囊泡吸收。含有稳定ACC的细胞内囊泡被分泌到子宫液中，以靶向矿化位点(图5）。主要由跨细胞途径提供的额外钙/碳酸氢根离子将允许方解石在壳矿化的初始和后续阶段在矿化前沿生长。
图5 细胞外囊泡(EVs)在蛋壳钙化中的作用
（二）基质蛋白的时空沉积与方解石晶体取向
图6 蛋壳沉积不同阶段示意图
矿化始于排卵后5小时ACC的大量积累。ACC转化为ACC聚集体(6h)，然后形成较大的晶体单元，其c轴逐渐垂直于表面(7-10h)。栅栏层沉积(10-22h)，所有的晶体都垂直于表面。产卵前2小时，矿化停止，薄的有机角质层沉积。箭头表示方解石晶体的c轴方向
第一阶段为起始阶段(排卵后5至10小时，卵黄进入输卵管)。这个阶段开始时，蛋壳重量(0.18g)与完整蛋壳重量(5g)相比非常低，由蛋壳膜纤维及其富含有机物的圆形表面结构(乳状突起)组成。该阶段为矿化“缓慢”阶段，每小时沉积0.1g蛋壳，并分为3步，对最终蛋壳机械强度至关重要。排卵后5小时，形成扁平的圆盘状ACC颗粒，颗粒在整个膜表面成核，特别是在乳状突起。在此之后，沉积在有机成核位点的ACC让位于方解石微晶的聚集体(排卵后6小时)。此时，方解石晶体向各个方向(球晶)定向。在接下来的3小时(排卵后7-10小时)中，方解石晶体生长形成乳突层，方解石晶体c轴逐渐垂直于表面。晶体生长中的这种各向异性有利于晶体的出现，其c轴(最快生长方向)大致垂直于卵表面。
第二阶段是快速生长阶段，线性沉积为0.33g/h。当相邻的锥体融合(排卵后10小时)时，该阶段开始，形成一个连续的致密层(栅栏层)，并继续生长。该阶段持续12小时，对应于约4g蛋壳的沉积，蛋壳被组织成柱状方解石单元，其首选方向垂直于蛋壳表面。
最后，在产卵前2小时，终末期的特征在于钙化停止和薄有机层(角质层)的沉积，这构成了覆盖壳的生物膜并阻塞气孔以限制细菌通过壳的渗透。
如上所述，有机基质蛋白在控制壳钙化的不同阶段中起着主导作用。基质蛋白参与ACC的稳定，并控制晶体的多态性矿物相、形态和大小。约300种基质蛋白的空间分布和丰度时间变化与蛋壳形成的不同阶段相关。直接参与壳矿化的蛋白质(矿化蛋白，能够结合钙或二价离子)与间接与钙化过程相关的蛋白质(参与调节定向矿化的蛋白质)区分开来(图7)。
图7 蛋壳矿化过程中5个时间点的矿化顺序事件和主要基质蛋白示意图
字体大小对应蛋壳提取物中的相对蛋白质水平。a直接参与壳矿化的蛋白质。已确定在生物矿化中起作用的蛋白质用黑色字母表示。带有钙结合结构域的蛋白质用红色字母表示。紫色表示蛋白聚糖和蛋白聚糖结合蛋白。b参与矿化蛋白调控的蛋白质。绿色字母表示伴侣蛋白，蓝色字母表示蛋白酶和蛋白酶抑制剂
四、参与壳矿化的蛋白质
（一）直接参与壳矿化的蛋白质
这组蛋白直接参与蛋壳矿化的矿化过程。包括蛋清蛋白、蛋壳蛋白和蛋白聚糖。蛋清蛋白包括卵转铁蛋白 (OVOT)、溶菌酶 (LYZ) 和卵清蛋白 (OVA) ，证据表明它们参与了ACC的稳定并影响壳矿化过程中方解石晶体的形态。蛋壳蛋白的另一个重要类别是钙结合蛋白 (Ca BP)，它们与钙相互作用以促进晶体成核并指定晶体的形态(图中红色表示的蛋白质，7a)。蛋白聚糖是另一类在生物矿化过程中直接与钙相互作用的主要参与者，这些大分子将蛋白质核心与带负电荷的复杂多糖结合在一起，这些多糖与钙强烈相互作用，这种蛋白质在骨矿化中具有额外的作用。
（二）参与调节指导矿化的蛋白质
该组由子宫液蛋白组成，这些蛋白与参与矿化的蛋白质相互作用。例如OCX-32、OCX-36等，其中一些蛋白可以指导钙和矿物质的正确组合折叠，以及抗菌和抵抗病原体侵害的作用。
五、结尾
蛋壳是一种具有钙质矿物相和有机相的复合材料，其相互作用决定了其超微结构和由此产生的机械性能。鸡蛋是全世界广泛消费的食物，每年生产超过 13000 亿个单位。因此，作为一种基本食品和重要的农产品，其蛋壳质量对人类粮食安全至关重要。文章全面介绍了蛋壳的结构、形成以及影响因素。依据文章提供的研究成果，为从遗传育种、营养调控等角度提高蛋壳质量提供了可行性方向。
博农利深耕动物营养，紧跟前沿成果，关注行业痛点，积极探索，为家禽蛋壳品质的提升而不断努力！
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